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酷站素材,网页设计制作公司报价,WordPress评级评分主题,驾校网站建设关键词热稳定性分析#xff08;Thermal Shift Assay, TSA#xff09;该方法亦被称为差示扫描荧光法#xff08;Differential Scanning Fluorimetry, DSF#xff09;#xff0c;其原型理念源于蛋白质化学中对蛋白质稳定性的研究。随着实时荧光定量PCR#xff08;qPCR#xff09…热稳定性分析Thermal Shift Assay, TSA该方法亦被称为差示扫描荧光法Differential Scanning Fluorimetry, DSF其原型理念源于蛋白质化学中对蛋白质稳定性的研究。随着实时荧光定量PCRqPCR仪的普及和专用荧光染料的开发TSA凭借其惊人的简易性、低成本和高通量优势迅速成为制药公司及学术实验室在药物筛选中不可或缺的“守门员”技术。01实验原理在天然蛋白质中其内部的疏水区域被紧密折叠包裹。此时SYPRO Orange染料在水溶液中荧光信号极弱。然而当蛋白质在加热过程中开始变性、结构松散时原本隐藏的疏水内核会暴露出来。SYPRO Orange能迅速结合这些暴露的疏水斑块一旦结合其荧光强度会激增数百倍。图1 TSA实验原理图来自网络。1将蛋白质与SYPRO Orange染料混合。2在实时荧光定量PCR仪中对样品进行缓慢而均匀的升温例如从25°C升至95°C。3仪器持续监测荧光强度。初始阶段荧光很低随着温度接近蛋白质的变性点结构大规模展开染料大量结合荧光信号陡然上升。4最终得到一条熔解曲线其拐点所对应的温度即为熔点Tm它精确代表了蛋白质的热稳定性。如果向蛋白质中加入能与之特异性结合的小分子如药物候选化合物该分子往往会像“分子胶”一样稳定蛋白质结构使其更耐热。这会导致熔解曲线向右移动即测得的Tm值升高。通过这种简单的Tm值偏移研究人员就能快速判断小分子是否与目标蛋白结合从而高通量地筛选药物或优化蛋白质制剂。02结果解读Lynn等人通过TSA技术来研究目标蛋白POT1与寡核苷酸分子结合验证在单独POT1蛋白和POT1阴性分子不与POT1结合的分子的荧光峰值出现在50°C附近而加目标分子寡核苷酸O1后荧光峰值出现在了65°C附近Tm值发生了偏移。说明加目标分子寡核苷酸O1后使目标蛋白POT1结构更加稳定且耐热两者存在互作可能性。图2 TSA结果解读DeLeeuw et al., 2021。参考文献DeLeeuw L W, Monsen R C, Petrauskas V, et al. POT1 stability and binding measured by fluorescence thermal shift assays[J].PLoS One, 2021, 16(3): e0245675.